北京大学人民医院张晓辉教授团队ITP相关研究进展盘点

第64届美国血液学会(ASH)年会于2022年12月10-13日在线上线下盛大召开，在今年ASH大会中，中国免疫学会血液免疫分会候任主委，中华医学会血液学分会副主委、造血干细胞应用学组组长，北京大学人民医院张晓辉教授团队共有2篇oral和5篇poster入选，其中3篇为移植后并发症相关研究进展，4篇为免疫性血小板减少症(ITP)相关研究进展，本文我们整理了ITP相关进展，以飨读者。

摘要号：914

中文标题：免疫性血小板减少症骨髓高维度免疫特征分析

第一作者：刘凤琪

通讯作者：张晓辉教授

异常的骨髓微环境被认为在ITP的进展中起着重要作用。质谱流式(CyTOF)是一种新的细胞蛋白表型分析方法，能够描述多种免疫细胞群的组成，发现新的生物标志物的特征。本研究的目的是概述ITP患者的骨髓细胞组成的高维度特征，总结细胞亚群及其功能变化，为发病机制和临床治疗提供思路。

2021年7月至10月间纳入确诊ITP患者40例(男21例，女19例)，年龄23-71岁(中位年龄47岁)。根据疾病的发病时间和进展，将ITP患者分为了3个亚组：ITP-N1组包括15例新诊断未治疗的ITP患者(病史≤3个月)，ITP-N2组包括10例未治疗的持续ITP患者(病史3-12个月)，ITP-R组包括15例接受标准治疗缓解后复发就诊的ITP患者。健康对照组(HC组)骨髓样本由10名造血干细胞移植供者捐献。

ITP患者血小板计数范围为(1~96)×109/L，中位数为25×109/L。利用CyTOF技术，将骨髓中的免疫细胞分为7个主要亚群，包括B细胞、γδT细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)和单核细胞。对比ITP患者和健康对照的骨髓细胞组成，DC和单核细胞的比例有显著差异。观察到ITP患者骨髓中单核细胞比例明显增加。在ITP患者中，DC中的pDC亚群比例呈下降趋势，而mDC的比例明显升高。根据CD56分子表达的不同，研究者将NK细胞分为2个亚群，亚群之间具有不同的细胞因子产生模式和细胞毒功能。与健康对照相比，ITP-R组患者CD56dim NK细胞比例升高，CD56bright NK细胞比例明显降低;ITP-N1组和ITP-N2组未观察到类似结果。这提示ITP骨髓中的NK细胞可能在ITP复发中发挥作用。

研究者进一步结合T细胞表面共刺激和共抑制分子的表达，研究了ITP患者T细胞的功能状态。结果显示，ITP患者骨髓中CD4+和CD8+ na?ve T细胞比例均降低，CD8+效应T细胞的比例明显增加。我们发现，共抑制分子CTLA4在CD8+效应T细胞和CD4+ Tfh细胞中表达减少，共刺激分子如CD28和ICOS在CD4+中心记忆T细胞中表达更多。结合血浆中可溶性因子的检测，发现血浆中B7.2水平与T细胞表面CD28表达呈正相关，与CTLA4的表达呈负相关。

研究结论

本研究结果表明，ITP不同阶段骨髓免疫细胞的比例变化和免疫检查点分子的表达模式可能为ITP的病理机制提供新的见解，并为ITP提供有前景的临床治疗靶点。

摘要号：2454

中文标题：艾拉莫德治疗慢性/难治性ITP的现实研究

第一作者：安倬玉

通讯作者：张晓辉教授

艾拉莫德是一种小分子化合物，是在中国和日本被广泛用作治疗类风湿关节炎的新型抗风湿药物。艾拉莫德抑制几种炎性细胞因子的产生，包括IL-1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)，并减少免疫球蛋白的产生。类风湿性关节炎患者在接受艾拉莫德治疗后，Th1和Th17细胞计数显著减少。异常的T细胞功能和抗血小板抗体的产生在ITP的发病机制中起着重要作用，而艾拉莫德是一种可能用于治疗ITP的药物。本研究的目的是研究伊格拉蒂莫德对ITP治疗的影响。

该研究于2020年12月开始，目前正在进行中。共有76名患者接受了至少3个月的艾拉莫德治疗。其中51名患者接受了超过6个月的治疗，30名患者至少接受了12个月。5名患者在3个月后退出观察：2名患者因NR，3名患者因疫情和财务原因，无患者因AE退出治疗。主要及次要终点包括第14天的初始反应(OR，血小板计数≥30×109/L，基线血小板计数至少增加2倍，无出血;CR，血小板计数≥100×109/L)、缓解持续时间、出血评分和不良事件(AE)。

基线时，73.5%的患者报告1至4级出血症状。治疗3个月后，出现任何出血症状的患者比例降至61.8%，并在整个研究期间始终低于基线水平。在基线时，63名患者报告使用了联合用药，在3至6个月期间减少了36.5%。最常停用或减少的药物是糖皮质激素和利妥昔单抗。

研究结论

艾拉莫德治疗ITP具有良好的疗效和安全性，有可能成为ITP的新治疗方法。

摘要号：3771

中文标题：肠-胆汁酸-免疫轴调控T细胞稳态在免疫血小板减少症发病机制中的作用

第一作者：刘凤琪

通讯作者：张晓辉教授

在之前的一项研究中，研究者观察到ITP患者肠道微生物组的物种组成失衡和功能失调[Sci China Life Sci, 2020]。肠道屏障受损以及肠道菌群相关代谢产物可能提供信号分子，促进肠道与免疫系统之间的交流。例如，胆汁酸(BAs)在肝脏中合成，并在肠道中转化为次级BAs，最近被认为是免疫系统的重要信号代谢产物。胆汁酸受体法尼醇受体(FXR)还能抑制TLR4/MAPK通路，参与调节免疫应答。本研究探究了肠-胆汁酸-免疫轴在ITP的发病机制中的作用，并且发现奥贝胆酸(OCA)治疗可以修复肠道屏障，恢复肠-胆汁酸平衡，以减少ITP中血小板的破坏。

通过构建ITP主动型小鼠模型，采用组织病理分析、16S扩增子测序、靶向胆汁酸代谢组学和实时荧光定量PCR等方法，探讨肠道屏障功能、肠道菌群组成及粪便和血浆中胆汁酸代谢物的变化。使用OCA对小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)进行体外干预及ITP小鼠模型体内治疗，研究OCA对肠道胆汁酸代谢和T细胞分化的影响。在临床样本研究中，我们纳入了65例未治疗ITP患者和62例健康对照，采集骨髓及粪便样本，利用宏基因组测序、胆汁酸靶向代谢组学和流式细胞术探讨ITP患者“肠-胆汁酸-免疫”轴的特征。

在ITP小鼠模型中，肠道屏障被破坏，H&E染色显示IECs脱落，FITC -右旋糖酐从肠粘膜渗漏进入外周循环。肠道上皮细胞转录组RNA测序显示，ITP小鼠claudin-4和claudin-8的表达显著降低。由于肠道屏障受损，ITP小鼠血浆中LPS水平升高。16S扩增子测序结果显示，肠道菌群中厚壁菌门:拟杆菌门比例升高，粪便中BAs含量升高，尤其是β-MCA等初级BAs含量增加。作为FXR拮抗剂，β-MCA的积累抑制了肠道上皮细胞、肝细胞和免疫细胞中FXR的活性。在体外FXR拮抗剂Z-guggulsterone刺激后，观察到小鼠骨髓来源的DC诱导Th1分化增加，这可以被FXR激动剂(GW4064或OCA)逆转。DCs分泌IL-12可诱导Th1分化，并受TLR4/MAPK/p38通路调控;OCA可通过激活FXR抑制TLR4通路的活化。在体内，OCA增加了ITP小鼠肠道claudin-4和claudin-8的表达，恢复了胆汁酸代谢的平衡。经过OCA治疗后，ITP小鼠骨髓中Th1/Th2失衡得到纠正，体内活体成像观察到ITP小鼠脾脏和肝脏中血小板破坏明显减少。

ITP临床样本研究表明，ITP患者肠道菌群失调，表现为厚壁菌门丰度增加。ITP患者的胆汁酸池显示骨髓中初级BAs的比例增加。体外提取培养ITP骨髓单个核细胞，经OCA体外干预72h后，人骨髓单个核细胞中Th1细胞比例明显降低，提示OCA对ITP患者有治疗作用。

研究结论

本研究初步揭示了ITP患者和小鼠模型中“肠-胆汁酸-免疫”轴的特征，体外和体内研究证实，OCA可以修复肠道屏障，纠正肠道菌群失调和胆汁酸代谢异常，并通过MAPK信号通路减少DC诱导的Th1细胞分化，减少ITP血小板的破坏。本研究为临床靶向“肠-胆汁酸-免疫”轴治疗ITP提供了理论依据。

摘要号：3872

中文标题：西格列汀通过AMPK/mTOR途径抑制免疫性血小板减少症患者巨噬细胞的过度自噬以促进巨核细胞生成

第一作者：吴瑾

通讯作者：张晓辉教授

骨髓巨噬细胞(BM MΦ)在调节ITP患者巨核细胞生成中的特殊作用尚未阐明。据报道，西格列汀是一种DPP-4抑制剂，通过调节SDF-1α和几种集落刺激因子，在造血细胞的产生和植入中发挥关键作用，促进造血干细胞和造血祖细胞的恢复。然而，西格列汀是否有促进ITP巨核细胞成熟和血小板生成的潜力尚不清楚。因此，本文探索巨噬细胞自噬对ITP患者巨核细胞生成的影响，并研究其在ITP发病机制中的潜在作用，探索西格列汀是否可能成为ITP的潜在治疗药物。

BM MΦ和CD34+细胞分离自ITP患者和健康对照受试者。通过WB检测和透射电镜证实了ITP患者骨髓巨噬细胞中的过度自噬。PCR和Western blotting用于评估ITP-MΦ中A20和自噬相关的AMPK/mTOR/ULK1通路蛋白的表达。携带A20 cDNA/shRNA的载体被转入到来自健康对照受试者或ITP患者的BM MΦ中。不同BM MΦ群体分别与CD34+细胞共培养。研究者比较了BM MΦ支持巨核细胞生成的能力，通过流式细胞仪测定不同阶段MKs的相对百分比以及培养物中巨核细胞和血小板的计数。体外评估了西格列汀恢复ITP-MΦ受损自噬的机制。

LC3-II/LC3-I和Beclin1在ITP-mφ中表达增加，而P62的表达减少。自噬小泡的数量也增加，表明ITP-mφ的自噬作用增强。进一步的研究证实，ITP-mφ调节巨核细胞生成，这依赖于A20介导的自噬相关的AMPK/mTOR/ULK1途径。用A20-shRNA抑制A20表达抑制了AMPK/mTOR/ULK1通路，减轻了ITP-MΦ中过度的自噬，从而增加了ITP-mφ共培养系统中巨核细胞的数量、高倍体巨核细胞的比例和产生的血小板数量。用自噬抑制剂3-MA抑制自噬逆转了MΦ中A20过度表达诱导的过度自噬，并使巨核细胞的分化和成熟正常化。用AMPK抑制剂Compound C抑制AMPK/mTOR/ULK1信号通路逆转了A20过度表达诱导的AMPK/mTOR/ULK1自噬通路的增强。发现西格列汀在体外抑制ITP-MΦ中A20和AMPK/mTOR/ULK1自噬通路蛋白的表达。西格列汀提高了ITP-MΦ促进巨核细胞分化发育和血小板生成的能力。总共有56名皮质类固醇耐药性或复发性ITP患者接受了西格列汀治疗。11例(19.6%)患者观察到完全缓解，21例(37.5%)患者观察到完全缓解。

研究结论

A20介导AMPK/mTOR/ULK1信号通路调节ITP-MΦ细胞的自噬，并影响巨核细胞生成和血小板形成。西格列汀可以抑制ITP-MΦ中A20介导的AMPK/mTOR/ULK1信号通路，从而促进巨核细胞生成。西格列汀在皮质类固醇抵抗/复发性ITP患者中产生持续反应，并表现出良好的安全性。

参考来源：

1.Feng-Qi Liu, Qingyuan Qu, Qi Chen, et al. High Dimensional Mapping of Bone Marrow Immune Characteristics in ImmuneThrombocytopenia. 2022 ASH. Abstract#914.

2.Zhuo-Yu An, Ye-Jun Wu, Yun He, et al. Real-World Study of the Use of Iguratimod to Treat Chronic/Refractory ITP. 2022 ASH. Abstract#2454.

3.Feng-Qi Liu, Qingyuan Qu, Yu-xiu Chen, et al. Gut-Bile Acid-Immune Axis Regulates T Cell Homeostasis in the Pathogenesis of Immune Thrombocytopenia. 2022 ASH. Abstract#3771.

4.Jin Wu, Yun He, Haixia Fu, et al. Sitagliptin Alleviates Excessive Autophagy in Macrophages in Immune Thrombocytopenia Patients to Promote Megakaryopoiesis Via the AMPK/mTOR Pathway. Abstract#3872.

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